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淺述熒光定量PCR試劑盒的操作方法
點擊次數:30 發布時間:2021-03-10
  一、病毒DNA的提取
  1、取出已處理的樣品、陰性對照和陽性對照,分別加入600/L抽提液(用抽提液之前不要晃動,不要吸到上層保護液),用力顛倒10次混勻,12,000rpm離心10min。
  2、取500/L上清置于滅菌離心管中,加入500/L異丙醇,混勻,置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出樣品管,室溫融化,13,000rpm離心15min。
  3、棄上清,沿管壁緩緩加入1mL洗滌液,輕輕旋轉一周后倒掉,將離心管倒扣于吸水紙上1min,再將離心管真空抽干15min或37℃烘干。
  4、用30/L無菌水溶解沉淀,作為模板備用。
  二、樣品制備
  1、樣品采集:病死或撲殺的豬,取大腦海馬背側皮層、中腦、腦橋、扁桃體、淋巴結等組織;待檢活豬,用棉拭子取鼻腔分泌物,置于50%甘油生理鹽水中,或用注射器取血5mL,2~8℃保存。(要求送檢病料新鮮,嚴禁反復凍融。)
  2、樣品處理:
 ?。?)組織樣品的處理:稱取組織0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理鹽水繼續磨至無塊狀物;然后將樣品轉至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心5min,取上清100/L于1.5mL滅菌離心管中,加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
 ?。?)全血樣品的處理:待血凝后取血清放于離心管中,8000rpm離心5min,取上清100/L于1.5mL滅菌離心管中,加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
 ?。?)陽性對照的處理:混勻后取100/L于1.5mL滅菌離心管中,加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
 ?。?)陰性對照的處理:混勻后取100/L于1.5mL滅菌離心管中,加入500/L裂解液和10/L蛋白酶K,混勻后37℃溫育1h。
  三、PCR
  1、反應體系:分別取16/LPCR反應液A(用前混勻)、2/LPCR反應液B(用前混勻)和2/L模板DNA,混勻。
  2、反應程序:在PCR儀上運行以下程序:94℃3min;94℃30s、55℃30s、72℃30s,35個循環;72℃延伸10min。
  四、電泳
  1、制膠:用50倍稀釋的TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠。
  2、電泳:待膠凝固后,取5/LPCR擴增產物點樣于瓊脂糖凝膠孔中,以5V/cm的電壓于50倍稀釋的TAE電泳緩沖液中電泳。
  3、染色:取50倍稀釋的TAE電泳緩沖液30mL,加入10/L染色液,混勻后將膠浸泡30min,于紫外燈下觀察結果。
  希望上述內容能夠幫助您更好的了解熒光定量PCR試劑盒的試驗方法。
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